Anticorps monoclonaux anti-BChE : du développement chez des souris knock-out à la valorisation

Le contexte

Les anticorps sont des outils extrêmement puissants de par leur spécificité et leur simplicité d’utilisation. Utilisés aussi bien pour la recherche, la purification, le diagnostic en santé humaine et animale, la détection et l’analyse de molécules, et depuis quelques années, comme outils thérapeutiques, les anticorps sont des outils essentiels.

Ainsi, des dizaines de milliers d’anticorps ont été développés contre toutes sortes d’antigènes.

Néanmoins, certains antigènes sont de nature peu immunogène (molécule de petite taille, protéine endogène, protéine présentant de fortes homologies avec des protéines de l’hôte,…), il est alors difficile de générer une réponse immune et des anticorps. Diverses stratégies sont couramment utilisées pour contourner le manque d’immunogénicité : utilisation de stratégies d’immunisation sophistiquées ou développement de banques d’anticorps recombinants. Ensuite, il n’est pas acquis que l’anticorps obtenu, bien que spécifique de l’antigène, reconnaisse spécifiquement la protéine choisie.

Confrontés à ces difficultés sur des antigènes traditionnellement problématiques, le Dr Krejci et son équipe du Centre d’Etude de la Sensori-Motricité (CESeM), Université Paris Descartes – CNRS UMR8194, Paris, France, ont souhaité développer une stratégie qui puisse être une alternative aux méthodes classiques.

La problématique du Client

Le Dr Krejci travaille depuis plus de 20 ans sur la génétique moléculaire des cholinestérases. Au début des années 2000, dans le cadre de ses recherches, il a eu besoin d’anticorps spécifiques de la ButyrylCholinEsterase (BChE)…

A la recherche d’anticorps sur le marché…

Le Dr Krejci s’est tourné dans un premier temps vers les réactifs du commerce. Il n’a trouvé aucun anticorps contre la BChE de souris, et seulement 2 anticorps dit « spécifiques » de la BChE humaine commercialisés par une même société. Aucun de ces 2 anticorps n’était utilisable chez la souris. Il n’y avait donc dans le commerce aucun anticorps monoclonal ou polyclonal reconnaissant la BChE de souris ou de rat en histochimie, immuno-précipitation ou western blot.

Pas d’anticorps satisfaisants…Ce n’est pas grave, il n’y a qu’à développer ses propres anticorps !…

Avec l’aide de ses collaboratrices, le Dr Anna Hrabovska et Véronique Bernard, le Dr Krejci décide de générer ses propres anticorps anti-BChE. La problématique de la BChE en tant qu’antigène est que cette protéine est fortement glycosylée, abondante dans le sérum et présente une forte conservation de séquence entre les espèces.

Il fait donc appel à une technologie particulière, selon lui encore trop peu exploitée pour le développement d’anticorps : les souris knock-out.

Il démarre alors un programme d’immunisation de souris auxquelles il injecte la protéine BChE sous différentes formes (BChE recombinante humaine ou murine, BChE purifiée du sérum humain, native ou dénaturée).

A sa grande satisfaction, les tests effectués sur les sérums des souris ont révélé que ces dernières avaient bien développé des anticorps reconnaissant spécifiquement la BChE de souris in situ.

Tissus de souris wild-type	Tissus de souris knock-out

Génial,  les souris répondent !... Il faut maintenant générer les anticorps monoclonaux ...

L’étape suivante était naturellement de sélectionner et produire des anticorps monoclonaux. Ne maîtrisant pas ces technologies, le Dr Krejci a décidé de faire appel à un partenaire spécialisé dans ce domaine. Pour lui, il était important que ce partenaire soit une société avec une grande expertise et un savoir-faire reconnu dans le développement et la production d’anticorps monoclonaux, assez réactive et flexible pour accepter de recevoir ses souris immunisées et permettre que le crible soit réalisé par son équipe. C’est ainsi que son choix s’est porté sur P.A.R.I.S.

L’objectif du Dr Krejci était d’obtenir, à partir des souris knock-out sans BChE immunisées par ses soins, des anticorps monoclonaux anti BChE pan-spécifique (non spécifique d’une espèce) et des anticorps monoclonaux reconnaissant spécifiquement la BChE de souris pour une utilisation en ELISA et in situ.

Une fois les meilleurs hybridomes sélectionnés, il souhaitait disposer de quantités d’anticorps suffisantes pour mener ses travaux de recherche, et sécuriser ces clones pour assurer leur pérennité.

A cela s’ajoutait d’autres exigences essentielles pour lui : être informé de manière régulière sur l’avancée des travaux, participer à la sélection des clones et aux prises de décisions importantes, avoir la garantie de la traçabilité des opérations avec des rapports détaillés.

Pour répondre aux objectifs du Dr Krejci, P.A.R.I.S a procédé en plusieurs phases :

• Développement des anticorps monoclonaux

• Evaluation et sécurisation des meilleurs clones

• Production et marquage des anticorps

Les programmes de développement, pilotés conjointement avec le Dr Krejci, ont permis de sélectionner une dizaine de clones parmi les milliers obtenus par la fusion. Parmi eux, 2 clones extrêmement intéressants de par leur spécificité et leur capacité de sécrétion : les clones « 11D8 » et « 4H1 ».

Pour l’un des programmes de développement d’anticorps monoclonaux, la sélection des hybridomes devait se faire selon une technique propre à l’équipe du Dr Krejci ; un transfert de ce protocole spécifique à l’équipe de P.A.R.I.S a été effectué avec succès.

Les clones développés étant précieux pour le Dr Krejci et son équipe, il a choisi d’en confier la sécurisation et la production d’anticorps à P.A.R.I.S. Les informations « archivées » lors des précédents projets (taux de sécrétion du clone, particularités,…) permettent de dimensionner et adapter les programmes aux lignées.

A l’écoute de ses clients et de leurs besoins, P.A.R.I.S leur fait bénéficier de son réseau, de son accès au marché, et de sa plateforme technique. C’est ainsi que P.A.R.I.S a pu mettre en relation le Dr Krejci, qui souhaitait valoriser ses clones, avec un autre client cherchant des anticorps anti BChE.

4H1 anti BChE Humaine
(A)             (B)
(A) 4H1 reconnait la BChE humaine et de souris produites dans des cellules COS. (B) Immuno-histochemistrie d’un muscle de jeune rat. A gauche, les récepteurs nicotiniques à l’acétylcholine sont visualisés avec une toxine marquée (Bung). A droite, 4H1 marque la BChE de rat

 

11D8 anti BChE Humaine
(C)	(D)	(E)
(C) 11D8 reconnait la BChE humaine produite dans des cellules COS, accrochée soit par ColQ soit par PRiMA comme illustré en microscopie. (D) Immuno-histochimie de junction neuromusculaire humaine. En haut, les récepteurs nicotiniques à l’acétylcholine sont visualisés avec une toxine marquée (Bung). En bas, l’anticorps 11D8 marque la JNM. (E) Western blot révélé avec l’Ac 11D8, (r)  BChE humaine recombinante, (wt) BChE purifiée du sérum , (*) après déglycosilation.

La Parole au Client

Pour s’assurer du succès de ses travaux de recherche, le choix du partenaire est d’une importance capitale.

D’abord contacté pour un besoin précis (le développement d’anticorps monoclonaux), P.A.R.I.S nous a proposé les services complémentaires au fur et à mesure de l’avancée du projet (production à différentes échelles, création de Banques, sécurisation des clones, …), nous avons ainsi pu conserver le même partenaire pour tout notre projet. Un partenaire efficace et flexible qui connaissait donc les enjeux et les contraintes et qui a su nous satisfaire.

Ce projet est un succès qui nous a permis : de capitaliser des données, d’avancer dans nos recherches, de publier les résultats de nos travaux, d’envisager la valorisation de nos clones, …

Bibliographie :

Hrabovska A, Bernard V, Krejci E (2010) A Novel System for the Efficient Generation of Antibodies Following Immunization of Unique Knockout Mouse Strains. PLoS ONE 5(9): e12892. doi:10.1371/journal.pone.0012892.